注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs在坐骨神经损伤的实验研究

时间:2021-01-15 所属分类 论文指导 作者有话说:期刊信息纠错
摘    要:目的 探讨注射型富血小板纤维蛋白联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)在坐骨神经损伤中的应用效果。方法选择10日龄SD乳鼠6只,雌雄不限,培养纯化BMSCs群备用;另选取2月龄SD大鼠24只,雌雄各半,随机分为观察组与对照组,各12只,以改良挤压损伤法制作大鼠坐骨神经损伤模型,观察组与损伤部位局部注射BMSCs悬液250μl及自体富血小板纤维蛋白250μl,对照组局部注射生理盐水500μl,治疗14 d后,比较治疗前后两组坐骨神经功能指数变化,治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图像及腓肠肌湿质量变化情况。结果 治疗前两组坐骨神经功能指数比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后观察组坐骨神经功能指数低于同组治疗前及治疗后的对照组(P<0.05);治疗14 d后,大鼠坐骨神经透射电镜提示观察组髓鞘轴突比例高于对照组,观察组腓肠肌湿质量高于对照组,且观察组腓肠肌湿质量恢复率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 针对坐骨神经损伤大鼠,使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs进行治疗,能有效提高坐骨神经功能,促进神经修复,提高平滑肌与血管再生能力。
关键词:注射型富血小板纤维蛋白 骨髓间充质干细胞 坐骨神经损伤 再生能力

外周神经损伤后其后续影响及功能恢复的病理生理过程十分复杂,神经组织的修复过程相对缓慢、再生生理较差[1],而且损伤后发生局部粘连、组织萎缩和运动终板退化可能性较大,进而导致神经功能的损伤修复受到影响,是目前显微外科重点与难点问题[2]。干细胞移植作为当今显微外科神经修复治疗的新型手段,骨髓间充质干细胞(BMSCs)是目前较为实用的种子细胞,尤其在外周神经损伤修复过程中发挥重要作用[3]。虽然其临床应用较为广泛,但其仍存有一定不足,如体外培养归巢率低,移植后细胞存活能力欠佳等[4]。注射用富血小板纤维蛋白具有较高的促生长因子释放率,从而更有效地诱导BMSCs的生产与分化[5]。为更好地提高外周神经损伤的修复治疗效果,本研究通过对大鼠应用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs进行治疗,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂
DMEM培养基由美国Hy Clone公司提供(生产批号:20180201),十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配胶试剂盒由上海碧云天生物科技公司提供(生产批号:201811058),CKX41型倒置相差显微镜由日本奥林巴斯公司提供,7000型透射电镜由日本东芝公司提供。
1.2 研究对象
选择10日龄SD乳鼠6只,雌雄各半,体重为25~35 g;另外选择2月龄SD大鼠24只,雌雄各半,体重195~225 g;均购自沈阳医学院实验动物中心(合格证号:20191105)。本研究造模及入组动物选择均通过实验动物伦理委员会审核同意,SD大鼠常温下适应性饲养1周备用。
1.3 方法
1.3.1 大鼠BMSCs及注射型富血小板纤维蛋白的制备
取6只乳鼠采用离颈法处死,采集由DMEM培养基从双侧胫骨干骺端冲洗骨髓,离心管反复吹打制备细胞悬液,随后严格按照密度梯度离心法进行细胞分离、培养和传代,选择培养3周后第4代纯化BMSCs群备用。注射型富血小板纤维蛋白以改良低速离心法进行,具体通过SD大鼠眼眶采血法采集自体血,置于低速离心管内离心3 min后获取浆液层与红细胞层中间的富血小板纤维蛋白层,所制备富血小板纤维蛋白无需抗凝,但要求在制备成功后15 min内应用。
1.3.2分组治疗
将24只2月龄SD大鼠随机分为观察组与对照组,各12只,以改良挤压损伤法制作大鼠坐骨神经损伤模型,先注射3%戊巴比妥实施腹腔麻醉,随后双侧后肢脱毛,无菌条件下对实验侧坐骨神经止血钳上齿挤压45 s,将坐骨神经积压呈扁薄状即为模型制备成功。造模后,观察组与损伤部位局部注射BMSCs悬液250μl及自体富血小板纤维蛋白250μl,对照组局部注射生理盐水500μl,治疗14 d后进行相关结果分析。
1.3.3 观察指标
比较治疗前后两组坐骨神经功能指数变化情况;分析两组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图像结果;统计两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况。坐骨神经功能指数为监测神经损伤后恢复情况的一种无创检测手段,以训练小鼠沿限定轨迹走动,并通过后爪不同颜色无毒染料印迹为标准,记录治疗前及治疗14 d后两组实验大鼠沿轨迹行走指标,结合爪长度、脚趾展开长度等综合计算,计算公式选择Bain公式进行,具体为SFI=109.5(ETS-NTS)/NTS-38.3(EPL-NPL)/NPL+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8 (N:正常足;E:伤侧足;PL:足印长度;TS:足趾宽度;IT:中间足趾宽度;),其中SFI=0为正常,SFI=-100为完全损伤;腓肠肌湿质量指标包括:健侧与实验侧腓肠肌湿质量数据,并计算腓肠肌湿质量恢复率,通过十万分之一精度电子天平秤测定治疗14 d后双侧腓肠肌湿质量,腓肠肌湿质量恢复率=实验侧(g)/正常侧(g)×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,两组间比较使用独立样本t检验,组内比较使用配对t检验,组间率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后坐骨神经功能指数变化的比较
治疗前两组坐骨神经功能指数比较,差异无统计学意义(P>0.05),治疗后两组坐骨神经功能指数低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05);且治疗后观察组坐骨神经功能指数低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。
表1 两组治疗前后坐骨神经功能指数变化的比较

2.2 两组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图像
两组大鼠坐骨神经透射电镜提示有髓鞘轴突比例情况提示,治疗14 d后,大鼠坐骨神经透射电镜提示观察组髓鞘轴突比例高于对照组(图1~2)。

图1 对照组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图(400×)

图2 观察组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图(400×)
2.3 两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况的比较
治疗后两组健侧腓肠肌湿质量比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后观察组实验侧腓肠肌湿质量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后观察组腓肠肌湿质量恢复率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。
表2 两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况的比较

3 讨论

神经组织损伤后虽具有一定的组织重塑能力,但随着微环境的改变为出现不可逆性改变[6],进而导致神经修复与再生能力被抑制,给目前临床上针对外周神经损伤的修复其仍属于治疗难点[7]。以往治疗上多以神经电刺激等进行治疗,虽具有一定效果[8],但整体疗效有待提高。近年神经支架、种子细胞及神经营养因子等生物工程手段的临床应用,为神经组织修复带来巨大突破[9]。
针对外周神经损伤,本研究制备大鼠坐骨神经损伤模型,其中观察组使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs进行治疗,结果显示,治疗前两组坐骨神经功能指数比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后观察组坐骨神经功能指数低于同组治疗前及对照组治疗后,差异有统计学意义(P<0.05)。证明针对大鼠坐骨神经损伤模型,使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs进行治疗,相对于注射生理盐水的对照组,能更好地促进坐骨神经功能指数的提高,促进坐骨神经功能的恢复。治疗14 d后,大鼠坐骨神经透射电镜提示观察组有髓鞘轴突比例高于对照组(P<0.05),提示自体注射型富血小板纤维蛋白联合BM-SCs在治疗大鼠坐骨神经损伤方面,促进损伤神经轴突再生具有重要意义。治疗14 d后,观察组腓肠肌湿质量高于对照组,且观察组腓肠肌湿质量恢复率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),进一步说明针对大鼠坐骨神经损伤模型,自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs治疗对促进平滑肌细胞增殖、血管形成等具有重要价值。
BMSCs是一种具有自我更新、多向分化和分泌功能的多能干细胞[10],以旁分泌集落刺激因子、干细胞生长因子、内皮细胞生长因子等多种细胞因子进而调节机体炎症反应,达到促进细胞修复,组织形成的目的[11-12]。另外,本研究使用的自体富血小板纤维蛋白联合BMSCs在神经局部鞘内注射,更好地为神经修复提供充足营养,并在15 min内注射,避免了凝胶状态[13],加大组织流动性,提高了临床应用效果;而且通过其释放的碱性成纤维细胞生长因子,显著提高BMSCs增殖与分化能力,并促进神经细胞的黏附、迁移效应,提高细胞外基质蛋白水平,进而更好地诱导BM-SCs增殖与分化[14-16],促进平滑肌细胞与血管的形成,确保神经组织血管的重塑与增殖,达到修复受损神经的目的[17-18]。
综上所述,针对坐骨神经损伤大鼠,使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs进行治疗,能有效提高坐骨神经功能,促进神经修复,提高平滑肌与血管再生能力。

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